Western Blot常見問題及處理（1）
1、western blot 的優(yōu)點
答： 靈敏，可達ng級，用Ecl顯色法理論上可達pg 級。方便，特異性高。
2、為什么我的細胞提取液中沒有目標蛋白？
答： 原因有很多：
a) 你的細胞中不表達這種蛋白質(zhì)，換一種細胞；
b) 你的細胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；
c) 你的抗體不能識別目標蛋白，多看看說明，看是否有問題。
3、我的細胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？
答： a) 有沉淀可能因為你的蛋白沒有變性完全，可以適當提高SDS 濃度，同時將樣品煮沸時間延長， b) 也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩沖液即可。
4、我做的蛋白質(zhì)分子量很?。?0KD），請問怎么做WB？
答：可以選擇0.2μml的膜，同時縮短轉(zhuǎn)移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可。
5、我的目的帶很弱，怎么加強？
答：可以加大抗原上樣量。這是最主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。
6、膠片背景很臟，有什么解決方法？
答：減少抗原上樣量，降低一抗?jié)舛龋淖円豢狗跤龝r間，提高牛奶濃度。
7、目標帶是空白，周圍有背景，是為什么？
答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上HRP 催化活力太強，同時你的顯色底物處于一個臨界點，反應時間不長，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現(xiàn)象”。將一抗和二抗?jié)舛冉档?，或更換新底物。
8、我的膠片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。
a) 二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光；
b) ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；
c) ECL底物沒覆蓋到相應位置；
d) 二抗失活。
9、我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片,是什么原因呢?
答：a) 可能是紅燈造成的, 膠片本來就被曝光了，可以在完全黑暗的情況下操作.看是否有改善.；b) 顯影時間過長。
10、DAB好還是ECM好？
答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的底物；ECM結果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原。要看你實驗的情況。
11、抗原檢測出的分子量比資料上的大，是怎么回事？
答：a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時間延長，可以打開二聚體。b)蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸化等。
12、蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上，但膠上有，同時Marker 轉(zhuǎn)上去了，為什么？
答：可能是：a)樣品濃度過低；b)轉(zhuǎn)移時間不夠。
13、磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等？
答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。
14、要驗證某個細胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗嗎？做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎？
答： ① 免疫組化可以用來進行定位，但是不能精確定量，而且有時會有假陽性，不易與背景區(qū)分；Western blot可以特異性檢測某個蛋白質(zhì)分子，進行定量，但是不能定位。
② 兩種實驗的一抗有時候不能通用，公司的產(chǎn)品說明一般都會說明可以進行什么實驗，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。
15、做Western Blot時，提取蛋白后凍存（未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的一抗，開始還有點痕跡，現(xiàn)在越來越差，上樣量已加到120μg，換了個santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎？
答：懷疑是樣品問題，可能是：
1，樣品不能反復凍融；
2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時，建議檢查Western Blot過程， 提高一抗?jié)舛?。對于加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。
16、細胞水平要做western blot，多少細胞提的蛋白夠做western blot？
答：一般5×10^6就足夠了。
17、同一樣品能同時提RNA又提蛋白么？這樣對western blot有無影響？
答：能，沒有問題。
18、同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎？
答：當然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。
19、如果目標蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？
答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑要溫和得多，這時最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
20、我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉(zhuǎn)膜時經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決？
答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉(zhuǎn)移時你可以用減少電流延長時間，加20％甲醇。
21、想分離的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適？積層膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎？
答：200kd的蛋白不好做， 分離膠用7％，積層膠 3.5％。
22、如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？
答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。
23、蛋白變性后可以存放多久？
答：－80℃，一兩年沒有問題。最關鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細菌消化掉(也是被酶水解了)。
24、我所測定的蛋白分子量是105KD，按理說分離膠應當采用7.5%，但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方，不知為何？
答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，因為105KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi)，但需注意條帶位置。
25、二抗是生物素化的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用5％的脫脂奶粉呢？好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的生成，是嗎？
答：不能使用脫脂奶粉，因為脫脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替應該好一點．
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